Es un cartón que combina dos temas populares en la pintura florentina del siglo XV: la Virgen y el Niño con San Juan Bautista (hijo de la pariente de María Isabel) y la Virgen y el Niño con Santa Ana (la madre de María). De esta manera, están representadas las tres generaciones de la familia de Cristo: santa Ana tiene a su hija María sobre las rodillas y esta última entretiene al Niño que se gira hacia san Juan.
Hay un sutil juego entre las miradas de las cuatro figuras, con santa Ana sonriendo a su hija María, mientras que los ojos de ésta se fijan en su hijo, al que también mira a san Juan. Santa Ana dirige a la Virgen una mirada extraña, llena de sentimiento, como si ya imaginase los sufrimientos que María deberá soportar durante la Pasión de Cristo.
Hay poca claridad en la delineación de los cuatro cuerpos; las cabezas de las dos mujeres, en particular, parecen surgir del mismo cuerpo. Leonardo se esforzó en reproducir un sentido policéntrico de movimiento, haciendo de modo que los dos personajes se fundiesen en un único complejo, en el que destaca la cabeza de santa Ana. La expresión de la Virgen María es extraordinariamente tierna, pero al mismo tiempo el rostro tiene una belleza majestuosa, ultraterrena, que sugiere la profunda devoción materna.
El enigmático gesto de santa Ana apuntando con su dedo índice hacia el cielo aparece nuevamente en dos de las últimas pinturas de Leonardo, su “San Juan Bautista” y su “Baco”, y es considerado como el gesto leonardesco por antonomasia. Parece sugerir con ello que hay sentimientos y pensamientos que quedan más allá de la normal comprensión humana. El paisaje del fondo apenas está esbozado.
Es infrecuente en un cartón que los perfiles nunca se hayan agujereado ni tengan incisiones, indicando que no había llegado el momento de transferir el diseño a la tabla en el que se pintaría. La composición es marcadamente diferente de la única obra de Leonardo que trata el tema de la virgen, el niño y santa Ana en el Museo del Louvre, en el que la figura del Bautista ha sido eliminada.